Hervé Cottin, astrochimiste au LISA, à l’université Paris Est Créteil, apporte quelques éléments de réponse à cette question.

Un reportage de 3min30 avec Marie-Christine Maurel, Biologiste, Université Pierre et Marie Curie, à regarder sur le site de l’INSU.

Par Patrick Forterre, Céline Brochier et Simonetta Gribaldo

Par Robert Pascal

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L’eau n’est pas seulement un solvant, c’est aussi un réactif nucléophile qui va transformer des espèces activées en produits inertes par hydrolyse. La plupart des biopolymères et des biomolécules étant hydrolysables, les êtres vivants doivent utiliser des sources d’énergie ou consommer des espèces activées pour se maintenir loin de l’état d’équilibre thermodynamique (non-vivant) où ces espèces seraient hydrolysées. Il devait en être de même aux premiers stades de la vie, ce qui fonde une démarche visant à examiner si les réactions potentiellement prébiotiques répondent aux critères thermodynamiques et cinétiques pour pouvoir constituer un protométabolisme, ce qu’a récemment exprimé Arthur Weber (2002) : « At the earliest stage, primitive metabolism probably would have been a chemometabolic process consisting of chemically spontaneous reactions having favorable free energies and favorable rate constants. With a very limited ability to redistribute energy or catalyze kinetically unfeasible reactions, the synthetic pathways of early chemometabolism would have been shorter and less complex than those of modern metabolism. » Ces contraintes doivent donc constituer un crible pour valider la pertinence de réactions envisagées aux stages précoces de la vie et lors de l’évolution chimique antérieure.
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Contenu énergétique des biomolécules et hydrolyse
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Le caractère riche en énergie des biomolécules hydrolysables peut être apprécié par leur affinité pour l’eau mesurée par leur équilibre d’hydrolyse :
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Mais, dans l’eau, l’état d’ionisation des espèces A–B, A–OH et B–H dépend souvent du pH à cause de la présence de fonctions acides ou basiques au sein de ces molécules. Si, par exemple, l’on forme une liaison peptidique (inverse de l’hydrolyse) à partir de deux segments peptidiques dont l’un porte la fonction acide carboxylique terminale [pKa (COOH) 3,5–4] et l’autre la fonction amine [pKa (NH3+) 7,5–8]. La constante d’équilibre Kpep se référant aux espèces considérées dans la partie gauche de l’équation est d’une utilité limitée car la zone de pH où ces deux formes sont majoritaires correspond à une gamme réduite (pH ≈ 4–7).
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En conséquence, la constante d’équilibre apparente Kapp, relative à la somme des concentrations des espèces sous forme acide et basique, va dépendre du pH (Fig. 1). C’est pourtant cette constante apparente qui nous intéresse car elle concerne des espèces chimiques isolables (le peptide et les segments) indépendamment de leur état effectif d’ionisation. La liaison peptidique est donc totalement instable en milieu acide et basique, elle l’est beaucoup moins entre pH 5 et pH 7. Une norme est nécessaire pour pouvoir comparer le contenu énergétique de différentes espèces ; l’usage est de considérer seulement les valeurs des constantes d’équilibre apparentes K’ en se plaçant à pH 7. Mais il faut garder à l’esprit que les conclusions obtenues de ces comparaisons sont uniquement valables dans ce contexte. Ces constantes d’équilibre sont calculées en considérant la concentration totale des espèces en jeu sans tenir compte de leur état d’ionisation :
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Le contenu énergétique d’une biomolécule sera alors chiffré par définition à l’aide de son enthalpie libre d’hydrolyse à 25°C et pH 7. deltaG°’ = – RT ln K’ Le caractère typographique ’ (prime) dans G°’ exprime simplement que l’activité de H+ considérée (a(H+) = 10–7 M à pH 7) ne correspond pas à l’état standard (1M). Les ouvrages de biochimie donnent généralement un tableau rassemblant les valeurs usuelles importantes en biochimie (Tableau 1). Ces valeurs permettent de définir des liaisons « riche en énergie » (anhydrides, thioesters, ATP, etc.) et d’autres, relativement pauvres, comme les esters d’acide phosphoriques, les esters et les peptides (amides). Une autre caractéristique de ce contenu énergétique est sa capacité à être transféré par des réactions chimiques couplées dans une chaîne métabolique.
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Activation biochimique des acides aminés
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L’activation des acides aminés en biologie est liée à la traduction du code génétique qui est universel. C’est donc un des vestiges les plus ancestraux de la biologie. Elle met en jeu différentes espèces, l’adénosine triphosphate (ATP), l’aminoacyl-adénylate (AA-AMP) , l’adénosine 5’ monophosphate (AMP), le pyrophosphate (PPi), l’ARN de transfert (tRNA) et l’ARN de transfert aminoacylé (AA-tRNA) :
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Elle s’effectue en deux stades :
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Ce système repose sur une famille d’enzymes, les aminoacyl-tRNA synthétases (aaRS), dont la sélectivité lors de l’aminoacylation (fixation d’un acide aminé sur le tRNA portant le triplet de bases correspondant) est la clef de la fidélité dans la traduction du code génétique. Du point de vue énergétique, l’enzyme stabilise les espèces instables (en particulier l’anhydride AA-AMP). Cette stabilisation a pour résultat « d’égaliser » les niveaux énergétiques des espèces mises en jeu ; la formation de l’aminoacyl adénylate sous forme liée à l’enzyme est alors très proche de l’équilibre (Holler and Calvin, 1972) :
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Mais cette stabilisation de l’AA-AMP par l’enzyme résulte d’une optimisation par l’évolution. Une des questions essentielles pour comprendre l’émergence du code génétique est de savoir comment ce système sophistiqué a pu apparaître en l’absence d’enzymes et donc d’aaRS (avant l’émergence de la machinerie de traduction).
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L’activation des acides aminés par l’ATP aux premiers stades est très improbable
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Les contenus énergétiques des espèces mises en jeu lors de l’activation biochimique des acides aminés ont été réunis et/ou estimés pour les formes libres en solution aqueuse (Tableau 2).
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La différence entre les contenus énergétiques de l’ATP et de l’adénylate AA-AMP indiqués dans le tableau 2 est de 33 kJ mol–1. Il est possible d’en déduire que l’activation des acides aminés par l’ATP (ou d’ailleurs d’autres polyphosphates) est fortement improbable hors du contexte de l’aminoacyl-tRNA synthétase qui stabilise l’anhydride mixte car l’équilibre entre les espèces libres en solution est fortement défavorable (K ≈ 10–6–10–5, contre K 1 dans le site actif de l’aaRS).
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Il reste donc à trouver une explication à l’émergence de ce chemin réactionnel métabolique qui ne répond pas au critère attendu pour une réaction spontanée malgré son rôle essentiel en biologie et son apparition précoce, probablement simultanée de celle de la traduction du code génétique.
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Les NCA comme précurseurs des anhydrides mixtes AA-AMP ?
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Le plus logique est de faire l’hypothèse que les AA-AMP se sont formés initialement par une autre voie, différente de la voie moderne, qu’ils ont trouvé une utilité en contribuant au fonctionnement des tout premiers êtres vivants et qu’ensuite ils ont été stabilisés par des enzymes. Reste à identifier leurs précurseurs qui doivent avoir un contenu énergétique voisin ou supérieur au leur (–deltaG°’ 65 kJ mol–1). L’examen du tableau 2 montre qu’une espèce possède le niveau énergétique requis : le N-carboxyanhydride d’acide aminé (NCA : –deltaG°’ 60 kJ mol–1). La réactivité des NCA avec le phosphate inorganique (Biron et al., 2004) et avec les nucléotides (Biron et al., 2005) a récemment démontré la possibilité d’une voie alternative de synthèse des AA-AMP.
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L’utilité des adénylates AA-AMP aux stades précoces pourrait résider, non pas dans la synthèse de peptides non-codés (les NCA sont capables de le faire bien plus aisément), mais dans l’activation des nucléotides, par exemple sous forme de triphosphate (pppN).
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Cette formation de nucléosides triphosphates est l’inverse de l’activation des acides aminés par l’ATP rejetée précédemment comme improbable, elle se déroule donc ici dans le sens thermodynamique favorable (bien que nécessitant sans doute un catalyseur, Cat). La synthèse possible d’ARN à partir de ces nucléotides activés (et sa réplication) pourrait être la force motrice expliquant l’évolution du système vers des catalyseurs stabilisant l’anhydride mixte (enzymes ou ribozymes) et améliorant son efficacité globale. La voie moderne aurait ensuite résulté de l’apparition de synthèses alternatives des nucléosides triphosphates (en particulier l’ATP) causant un renversement du flux réactionnel et rendant ainsi les premiers êtres vivants indépendants des synthèses abiotiques de NCA (désormais inutiles).
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Un autre argument qui plaide en faveur d’un rôle des NCA dans l’apparition de la machinerie de traduction du code génétique (ribosome, ARN de transferts) est leur possibilité de réaction spontanée avec les nucléosides phosphorylés en position 3’ (Biron et al., 2005) :
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Les nucléotides 2’-aminoacylés formés ont une structure ressemblant à celle des ARN de transfert chargés en acide aminé AA tRNA. Il est raisonnable d’avancer l’hypothèse qu’ils pourraient en être les précurseurs.
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Les NCA comme degré prébiotique maximal d’activation des acides aminés et comme transporteurs d’énergie

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Les acides aminés activés sont très facilement convertis en NCA s’ils ont un niveau énergétique suffisant (Brack, 1987) :

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En raison de la présence quasi certaine de CO2 dans l’atmosphère primitive, ceci veut dire que tout autre espèce de contenu énergétique supérieur (–deltaG°’ ≥ 60 kJ mol–1) aurait été convertie en NCA. Le fait que l’évolution ait conservé les adénylates AA-AMP comme degré maximal d’activation des acides aminés en biologie est cohérent avec ce dernier point ; ces espèces ont en effet un niveau énergétique proche de celui des NCA et leur interconversion avec eux est aisée et spontanée (ne nécessitant pas de catalyseur). Les NCA dont l’intervention comme forme activée des acides aminés pourrait être responsable d’une formation dynamique de peptide non codés (Commeyras et al., 2003) auraient donc joué un rôle beaucoup plus étendu.
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Conclusion
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Toute voie chimique potentiellement prébiotique doit être considéré sous l’angle de sa pertinence thermodynamique. En ce qui concerne l’activation des acides aminés, les contraintes thermodynamiques rendent la voie biochimique moderne quasiment irréalisable en l’absence d’un catalyseur évolué. Le fait de tenir compte des contraintes thermodynamiques, donc d’accepter que la conversion entre AA-AMP, d’un côté, et ATP et acide aminé, de l’autre, s’est déroulée tout d’abord dans le sens inverse de celui observé en biochimie, ouvre la possibilité d’une évolution graduelle ne nécessitant aucune discontinuité pour arriver au système moderne.
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Références
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• Biron, J.-P. and Pascal, R. (2004), Amino Acid N-Carboxyanhydrides : Activated Peptide Monomers Behaving as Phosphate-Activating Agents in Aqueous Solution, J. Am. Chem. Soc. 126, 9198–9199.
• Biron, J.-P., Parkes, A. L., Pascal, R., and Sutherland, J. D. (2005) Expeditious, Potentially Primordial, Aminoacylation of Nucleotides, Angew. Chem. Int. Ed. 44, sous presse.
• Brack, A., (1987), Selective emergence and survival of early polypeptides in water, Origins Life 17, 367-379.
• Commeyras, A.et al. (2003), Approche dynamique de la synthèse des peptides et leurs précurseurs sur la Terre primitive, In Gargaud, M., Despois, D., Parisot, J.P., – Reisse, J. (Eds) Les traces du vivant, Presses Universitaires de Bordeaux, Bordeaux, pp. 115-162.
• Holler, E., Calvin M. (1972), Isoleucyl Transfer Ribonucleic Acid Synthetase of Escherichia coli B. A Rapid Kinetic Investigation of the L-Isoleucine-Activating Reaction, Biochemistry 11, 3741-3752.
• Jencks, W. P. (1976), Free energies of hydrolysis and decarboxylation, In : Fasman, G. D. (ed) Handbook of Biochemistry and Molecular Biology, 3rd edn, Vol I Physical and Chemical Data. CRC Press, Cleveland, pp. 296-304).
• Pascal, R., Boiteau, L., Commeyras, A. (2005), From the Prebiotic Synthesis of -Amino Acids Towards a Primitive Translation Apparatus for the Synthesis of Peptides, Top. Curr. Chem., 259, 69-122.
• Weber, A. L. (2002), Chemical constraints governing the origin of metabolism : the thermodynamic landscape of carbon group transformations under mild aqueous conditions, Origins Life Evol. Biosphere, 32, 333-357.

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L’auteur Robert Pascal est membre du GDR exobiologie, est chargé de recherche au Laboratoire : Organisation moléculaire, Evolution & Matériaux Fluorés, dans le groupe de recherche Dynamique des Systèmes Biomoléculaires Complexes du CNRS.

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Par Purificacion Lopez-Garcia

Du point de vue de la biologie, l’habitabilité pourrait se définir comme l’existence des conditions physiques et chimiques nécessaires, mais aussi suffisantes, pour que la vie puisse se développer dans un environnement donné. Connaître ces conditions requiert à son tour définir la vie, afin de pouvoir 1) reconnaître les êtres vivants, 2) établir leurs propriétés communes et 3) déduire quelles sont donc les conditions essentielles pour leur existence.

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La vie
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Définir la vie n’est pas une tâche facile. Les définitions de la vie auxquelles on est parvenu sont nombreuses et arbitraires. Aucune n’est probablement pas satisfaisante car, quel que soit le critère utilisé, on trouve toujours des structures ou des systèmes dans la nature pour lesquels la classification vivant/non-vivant est problématique ou incertaine. En générale, on finit par définir la vie par ses propriétés. On pourrait distinguer deux groupes majeurs de définitions du terme « vie » :

• L’un fait remarquer les propriétés d’autoréplication et d’évolution. Ainsi, on a la définition adopté officiellement par la NASA : La vie est un système chimique auto-entretenu capable d’évolution darwinienne.

• L’autre, plus « cellulaire », attribue les propriétés d’autoréplication et évolution à une structure confinée et capable de réaliser du métabolisme. Ainsi, selon P. L. Luisi : La forme de vie minimale est un système circonscrit par un compartiment semi-perméable de sa propre fabrication et qui s’auto-entretient en produisant ses propres éléments constitutifs par la transformation de l’énergie et des nutriments extérieurs à l’aide de ses propres mécanismes de production.

Certaines argiles et certains virus informatiques pourraient être considérés vivants si on considère strictement la première définition. Un exemple problématique corresponde aux virus (biologiques) qui, par leur caractère parasite obligatoire, ne s’accommodent pas à aucune de ces définitions. En tout cas, même si leur position reste incertaine à la frontière du vivant, leur présence témoigne de l’existence d’une vie cellulaire de laquelle les virus dépendent absolument.

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La vie cellulaire

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Mis à part les cas problématiques, le biologiste peut opter pour utiliser un critère conservateur, tout à fait empirique, pour définir les propriétés essentielles de la vie en se limitant à considérer les organismes cellulaires. La cellule est l’unité de base de la vie, l’unité fondamentale de la matière vivante telle qu’on la reconnaît sans aucun doute. D’un point de vue thermodynamique, une cellule peut être considérée comme un système ouvert qui échange de la matière et de l’énergie avec l’extérieur. Les cellules sont des systèmes chimiques complexes qui possèdent les suivantes propriétés fondamentales :

• Métabolisme énergétique et nutrition. Les cellules acquièrent des composants chimiques de l’environnement, les transforment, et éliminent d’autres composants chimiques comme déchets afin de fabriquer leur propre matière organique et d’obtenir l’énergie nécessaire pour réaliser les différentes fonctions physiologiques.

• Croissance ou auto-réplication. Les cellules dupliquent leur matériel génétique et se divisent pour donner naissance à deux ou plus cellules similaires à la cellule mère.

• Evolution. Les cellules subissent des mutations (au niveau de leur matériel génétique) qui ont par conséquence la modification de leur descendance et sont soumises à l’action de la sélection naturelle.

Les cellules peuvent également avoir d’autres propriétés importantes comme la signalisation (réponse aux stimuli physico-chimiques de l’environnement et communication) et la différentiation (capacité de modifier leur structure au cours du cycle de vie, par exemple la formation des spores, des gamètes, la différentiation au sein d’un tissu particulier).

L’analyse des caractéristiques intrinsèques des cellules et des conditions environnementales dans lesquelles elles exercent leur activité et se multiplient nous renseigne sur les besoins indispensables à la vie. On peut établir ces conditions minimales à trois niveaux : la composition chimique des cellules (niveau moléculaire/biochimique), leur mode de fonctionnement (niveau métabolique/physiologique) et la relation qu’elles entretiennent avec le milieu environnant (niveau écologique).

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Les besoins chimiques et moléculaires

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On distingue deux grands types d’organisation cellulaire : les cellules procaryotes, de structure plus simple, dont le matériel génétique est directement imbibé dans le cytoplasme, et les cellules eucaryotes, plus complexes où, entre autres particularités, le matériel génétique est séparé du reste de la cellule par une double membrane formant un noyau. Malgré des différences importantes au niveau de la structure et du mode de fonctionnement entre cellules procaryotes et eucaryotes, toutes ont plusieurs éléments en commun :

• La présence de protéines, dont un grand nombre est conservé dans les trois domaines du vivant (archées et bactéries -les domaines procaryotes- et eucaryotes), notamment les ATPases de membrane, les protéines ribosomiques et celles impliquées dans les processus de transcription et traduction.

• La présence des membranes constituées par des lipides (et aussi quelques protéines) qui forment des barrières semi-perméables aux différents ions et molécules. Elles se disposent généralement en bi-couches dont les lipides disposent les têtes hydrophiles vers la surface externe et les queues d’acides gras hydrophobes vers l’intérieur.

• Matériel génétique composé d’ADN.

• Cytoplasme contenant des ribosomes (organites composés d’ARN et protéines) où se fait la synthèse de protéines.

• La présence de polysaccharides, par exemple faisant partie des protéines glycosylées ou de la paroi externe.

Ces dénominateurs communs nous donnent d’une part des pistes sur la nature du dernier ancêtre commun, et d’autre part confirment l’universalité de la biochimie sur terre. Les macromolécules qui constituent le vivant se réduisent essentiellement aux protéines, composées à leur tour par l’assemblage d’une vingtaine d’acides aminés, aux lipides, aux polysaccharides, et aux acides nucléiques. Et si on descend à la composition élémentaire des macromolécules cellulaires, toutes sont majoritairement formées de C, H, O, N, P et S. Mis à part de l’hydrogène, il s’agit d’éléments très abondants et facilement disponibles dans un grand nombre de planètes. La vie aurait pu les choisir par cette raison simple. Cependant, il y a d’autres éléments abondants, comme le Si, qui n’ont pas été choisis pour la biochimie. En fait, des modèles d’une vie basée sur le Si ont été proposés, mais une chimie à base de C semble irremplaçable par sa versatilité et flexibilité à l’heure de former des liaisons avec soit même et avec d’autres éléments.

Finalement, en plus d’une biochimie basée sur le C, la présence d’eau à l’état liquide est indispensable à la vie par ses propriétés de solvant bipolaire, également irremplaçable pour les réactions biochimiques.

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Les besoins physiologiques

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Pour fonctionner, les cellules ont besoin de deux choses essentielles, de la matière pour fabriquer sa propre matière organique, et de l’énergie, qu’elles nécessitent pour réaliser la plupart des réactions biochimiques. Il existe une grande diversité de métabolismes cellulaires, des manières d’obtenir de l’énergie et de fabriquer sa propre matière organique. Pour synthétiser leur matière, certains organismes utilisent des composés inorganiques, notamment du CO2 (autotrophes), et d’autres profitent de la matière organique existante (hétérotrophes). De même, pour gagner de l’énergie on trouve des stratégies diverses dans la nature (voir Tableau 1). Certains organismes utilisent la lumière (photosynthèse), d’autres utilisent l’énergie dégagée des réactions d’oxido-réduction faisant intervenir des composés inorganiques (chimiosynthèse), d’autres oxydent des molécules organiques partiellement (fermentation) ou totalement à l’aide de l’oxygène ou d’autres oxydants (respiration de l’oxygène, nitrate, sulfate…). La variété des couples redox utilisée dans la nature pour obtenir de l’énergie dans des réactions d’oxido-réduction est très large et on ne connaît probablement pas encore toutes les possibles réactions d’obtention d’énergie que les microorganismes procaryotes, les plus versatiles par le métabolisme, peuvent réaliser. Par conséquent, pour qu’une planète soit habitable, elle doit posséder des sources appropriées de matière (fondamentalement du CO2) et d’énergie (lumière et/ou couples chimiques redox utilisables).

Tableau 1. Classification des organismes selon leur métabolisme énergétique. D’après Fenchel (1998) and Madigan (1997).

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a Chlorophyll or bacteriochlorophyll act as temporal e- donors and acceptors in a light-driven cycle.
b Products liberated to the environment and not retained in the cell as reducing power or others.
c Reducing power accumulated in reduced NAD(P) is ultimately used for reductive assimilation of CO2.
d For CO2 fixation, the organic e- donor must be more reduced than cell material.
e Fermentation differs basically from respiration in the following : redox balance, no external e- acceptors, dismutation of organic substrate molecules anaerobically, substrate-level phosphorilation instead of an electron transport phosphorylation.

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Les conditions environnementales favorables

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Finalement, une dernière approche pour déterminer les conditions d’habitabilité d’autres planètes consiste à observer les limites de la vie sur terre. Au cours des derniers trente ans, ces limites se sont élargit considérablement grâce à l’exploration et découverte des microorganismes habitant des environnements extrêmes où les conditions physico-chimiques sont presque limitantes pour la vie (extrêmophiles), Le tableau 2 montre les fourchettes de plusieurs paramètres dans lesquelles la vie est connue.

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Tableau 2. Limites physico-chimiques de la vie sur Terre.

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* L’ancien record de température maximale, 113°C, correspondait à l’archée hyperthermophile Pyrolobus fumarii. Une nouvelle souche hyperthermophile isolée d’une source hydrothermale dans le Pacifique et qui respire du Fe (III) est capable de se multiplier à 121°C.
** Certaines études semblent indiquer que cette limite pourrait attendre des valeurs proches à 1 GPa.

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Bibliographie recommandée

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• Early life on Earth (1992) Nobel Symposium No. 84, S. Bengtson (ed.), Columbia University Press, New York, 630 pp.

• Fenchel, T., King, G. M. & Blackburn, T. H. (1998). Bacterial biogeochemistry : The ecophysiology of mineral cycling, Second edition edn : Academic Press.

• López-García, P. (2001) Extrêmophiles, limites du vivant. In “Les traces du vivant”, M Gargaud (editor), Presses Universitaires de Bordeaux, pp. 255-271

• López-García, P. (2005) Extremophiles. In « Lectures in Astrobiology », Vol. I, Gargaud M, Barbier B, Martin H & Reisse J (editors), Springer Verlag, Heidelberg, pp. 657-679.

• López-García, P. (2005) L’habitabilité du point de vue du biologiste. En « Des atomes aux planètes habitables », Gargaud M, Claeys, P & Martin H (editeurs), Presses Universitaires de Bordeaux, pp. 375-388.

• López-García, P. Habitability from a biologist’s viewpoint. In « Lectures in Astrobiology », Vol. II, Gargaud M, Claeys, P & Martin H (editors), Springer Verlag, Heidelberg, in press

• Lunine, J.I. (1999) Earth : Evolution of a habitable world. Cambridge University Press, Cambridge, 319 pp.

• Madigan, M. T., Martinko, J. M. & Parker, J. (1997). Brock Biology of Microorganisms, 8th edn. New Jersey : Prentice-Hall, Inc.

• Moreira, D. & López-García, P. (2005) Le dernier ancêtre commun des cellules modernes. En « Des atomes aux planètes habitables », Gargaud M, Claeys, P & Martin H (editeurs), Presses Universitaires de Bordeaux, pp. 389-398.

• Nisbet, E. G. & Sleep, N. H. (2001). The habitat and nature of early life. Nature 409, 1083-1091.

• Pace, N. R. (1997). A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science 276, 734-40.

• Rothschild, L. J. & Mancinelli, R. L. (2001). Life in extreme environments. Nature 409, 1092-1101.

• Nº spécial de La recherche, vol 317. Les frontières du vivant (1999)

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L’auteur, Purificación López-García est microbiologiste, responsable de l’équipe Diversité et évolution microbiennes à l’UMR 8079 (Ecologie Systématique Evolution) à l’université Paris Sud.

Par Suzanne Sommer

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1- Une capacité exceptionnelle à tolérer les lésions de l’ADN
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La bactérie Deinococcus radiodurans est surtout connue pour sa capacité exceptionnelle à surmonter l’effet létal et mutagène des agents qui endommagent l’ADN, en particulier les effets des radiations ionisantes, de la dessication et du rayonnement ultraviolet (Mattimore and Battista, 1996 ; Sweet and Moseley, 1974, 1976). Ces agents provoquent des dommages variés de l’ADN (oxydation de bases, cassures simple et double brins, dimères de pyrimidines) (Battista et al., 1999 ; Mattimore and Battista, 1996 ; Sweet and Moseley, 1974, 1976 ; Ward, 1975, 1988). La résistance de la bactérie D. radiodurans aux agents qui endommagent l’ADN n’est pas due à des mécanismes de protection de l’ADN qui empêcheraient la formation des lésions (Gerard et al., 2001) mais à une réparation particulièrement performante de ces lésions.

La viabilité de la bactérie D. radiodurans n’est pas affectée si elle est soumise à une irradiation γ provoquant environ 200 cassures double-brins, 3000 cassures simple-brins et plus de 1000 bases endommagées par équivalent génome (survie de 100 % pour une exposition à une dose de 6000 Gy de rayonnement γ) et sa survie reste très significative à des doses supérieures à 10000 Gy (Figure 1). A titre de comparaison, des doses 250 fois inférieures suffisent pour stériliser la majorité des cultures bactériennes (exemple : Escherichia coli) (Figure 1). La bactérie D. radiodurans est également très résistante à la dessication (Mattimore and Battista, 1996). En effet, on trouve encore plus de 80% de cellules viables dans des cultures séchées sur une lame de verre et gardées 2 ans dans un dessicateur.

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Les doses d’irradiation n’excédant pas 200 mGy par an dans les environnements naturels (Battista et al., 1999), il est peu probable que cette espèce ait acquis des mécanismes spécifiques pour résister à de fortes doses d’irradiation et sa radiotolérance résulte probablement d’expositions à des cycles répétés de dessication-réhydratation qui ont conduit à la sélection de mécanismes de réparation de l’ADN particulièrement performants. On peut également noter une résistance exceptionnelle à une exposition prolongée au rayonnement ultraviolet capable d’engendrer plusieurs milliers de dimères de pyrimidines dans son génome (5000 dimères de pyrimidines engendrés par une exposition à une dose de rayonnement UV de 500 J / m2).

Parmi les lésions provoquées par les radiations ionisantes, les cassures double brins sont considérées comme les plus redoutables sur le plan génotoxique (Ward, 1988). Une absence de réparation des cassures de l’ADN aboutit à la mort cellulaire alors qu’une réparation infidèle de ces lésions va conduire à des mutations et des remaniements chromosomiques qui sont à la base du développement de tumeurs ou de maladies héréditaires chez l’homme (Little, 2000). La bactérie D. radiodurans qui est l’organisme le plus radiotolérant identifié à ce jour constitue un modèle particulièrement bien choisi pour élucider les mécanismes de réparation des cassures de l’ADN. Une analyse génétique des mécanismes intervenant dans la réparation des cassures de l’ADN est facilitée par la transformabilité naturelle de cette bactérie. De plus la séquence complète annotée de son génome a été publiée (White et al., 1999).

Deinococcus radiodurans est capable de reconstituer un génome intact à partir d’une myriade de fragments engendrés par l’exposition des bactéries à des doses massives de radiations ionisantes ou par des cycles répétés de dessiccation/réhydratation (Figure 2).

Les doses d’irradiation n’excédant pas 200 mGy par an dans les environnements naturels (Battista et al., 1999), il est peu probable que cette espèce ait acquis des mécanismes spécifiques pour résister à de fortes doses d’irradiation et sa radiotolérance résulte probablement d’expositions à des cycles répétés de dessication-réhydratation qui ont conduit à la sélection de mécanismes de réparation de l’ADN particulièrement performants. On peut également noter une résistance exceptionnelle à une exposition prolongée au rayonnement ultraviolet capable d’engendrer plusieurs milliers de dimères de pyrimidines dans son génome (5000 dimères de pyrimidines engendrés par une exposition à une dose de rayonnement UV de 500 J / m2).

Parmi les lésions provoquées par les radiations ionisantes, les cassures double brins sont considérées comme les plus redoutables sur le plan génotoxique (Ward, 1988). Une absence de réparation des cassures de l’ADN aboutit à la mort cellulaire alors qu’une réparation infidèle de ces lésions va conduire à des mutations et des remaniements chromosomiques qui sont à la base du développement de tumeurs ou de maladies héréditaires chez l’homme (Little, 2000). La bactérie D. radiodurans qui est l’organisme le plus radiotolérant identifié à ce jour constitue un modèle particulièrement bien choisi pour élucider les mécanismes de réparation des cassures de l’ADN. Une analyse génétique des mécanismes intervenant dans la réparation des cassures de l’ADN est facilitée par la transformabilité naturelle de cette bactérie. De plus la séquence complète annotée de son génome a été publiée (White et al., 1999).

Deinococcus radiodurans est capable de reconstituer un génome intact à partir d’une myriade de fragments engendrés par l’exposition des bactéries à des doses massives de radiations ionisantes ou par des cycles répétés de dessiccation/réhydratation (Figure 2).
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2- Mécanismes de réparation des cassures de l’ADN

Les bases moléculaires de la radiorésistance de D. radiodurans sont encore peu comprises. La reconstitution d’un génome intact à partir de centaines de fragments fait appel à des mécanismes de recombinaison homologue impliquant la protéine RecA (figure 3) (Daly et al., 1994 ; Daly and Minton, 1995 ; Moseley and Copland, 1975), mais également à d’autres mécanismes indépendants de la protéine RecA agissant en conjonction avec la recombinaison homologue pour une réparation efficace des cassures (figure 4) (Daly and Minton, 1996). Des études biochimiques récentes ont mis en évidence des propriétés originales de la protéine RecA (Kim and Cox, 2002 ; Kim et al., 2002), en particulier sa capacité d’initier la recombinaison par fixation sur un substrat d’ADN double-brin, alors que toutes les expériences de recombinaison in vitro faites jusque là en utilisant des protéines RecA bactériennes ou leurs homologues Rad51 eucaryotes montraient que la formation d’un filament RecA (Rad51) sur un ADN simple-brin était un prérequis pour initier la recombinaison (Kim and Cox, 2002 ; Kim et al., 2002). Cette propriété particulière de la protéine RecA de D. radiodurans pourrait faciliter la réparation des cassures double-brin en ne rendant pas l’initiation de la recombinaison dépendante de la formation d’ADN simplebrin au niveau des extrémités.

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3- L’apport de la génomique dans l’élucidation des mécanismes de radiotolérance
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L’analyse de la séquence du génome de D. radiodurans montre l’existence de gènes impliqués dans les systèmes classiques de réparation des lésions de l’ADN (Makarova et al., 2001 ; White et al., 1999). On retrouve deux systèmes permettant d’éliminer les lésions UV, l’un faisant appel à une endonucléase spécifique coupant spécifiquement en 5’ des dimères de pyrimidines (Earl et al., 2002 ; Tanaka et al., 2005) et l’autre, à plus large spectre, capable d’éliminer les lésions encombrantes par excision d’un petit fragment simple-brin d’ADN qui porte la lésion (13 à 14 nucléotides) et resynthèse d’un ADN intact en prenant pour matrice le brin complémentaire (nucleotide excision repair = NER) (Agostini et al., 1996 ; Evans and Moseley, 1983 ; Narumi et al., 1997). De même, on retrouve la batterie classique de glycosylases capables d’éliminer de façon spécifique toute une série de bases modifiées (base excision repair = BER) (Sandigursky et al., 2004) ainsi que les gènes codant les protéines capables de reconnaître et de réparer les mésappariements de l’ADN assurant ainsi la fidélité de la réplication (mismatch repair = MMR) (Mennecier et al., 2004). Le gène recA codant la recombinase RecA ainsi que les gènes classiques codant les protéines responsables de la migration et de la résolution des jonctions de Hollyday sont présents. La question de l’initiation de la recombinaison et des mécanismes qui assurent la maturation des extrémités reste ouverte. On ne retrouve pas dans le génome de D. radiodurans de gènes homologues aux gènes recB et recC qui codent les activités nucléases et hélicases responsables de la formation à partir des cassures double-brins d’extrémités simple-brin nécessaires pour l’initiation de la recombinaison chez la bactérie E. coli. On retrouve par contre dans le génome de D. radiodurans les homologues des gènes Rad50 et Mre11 qui sont essentiels chez les eucaryotes pour l’initiation de la réparation des cassures de l’ADN par recombinaison homologue ou par recollement des extrémités. On retrouve également les homologues des gènes nurA et herA (Iyer et al., 2004), qui codent respectivement des protéines présentant des activités nucléases et hélicases chez les Archaea (Constantinesco et al., 2002 ; Constantinesco et al., 2004) et qui ont été proposés pour agir en conjonction avec les produits des gènes rad50 et mre11 dans la réparation des cassures de l’ADN (Constantinesco et al., 2002 ; Constantinesco et al., 2004).

L’analyse du génome a également permis de mettre en évidence la présence d’un gène codant pour une polymérase de la famille X, polymérases présentes chez les eucaryotes (Pol β, pol λ) mais très rares chez les procaryotes (Lecointe et al., 2004).

D. radiodurans étant une bactérie qui se manipule très bien génétiquement, de nombreuses études ont permis d’inactiver tous ces gènes et d’évaluer leur rôle potentiel dans la radiorésistance. Seule, l’inactivation du gène recA aboutit à un phénotype drastique de sensibilisation aux agents qui endommagent l’ADN (figure 3). L’inactivation des autres gènes engendre des phénotypes plus subtils, suggérant, soit une redondance de certaines fonctions, soit une pluralité de mécanismes qui, ensemble concourent à conférer une résistance exceptionnelle aux agents génotoxiques. On peut donner l’exemple de l’inactivation du gène polX qui se traduit par une sensibilisation uniquement pour des doses élevées d’irradiation γ et par un retard dans la cinétique de réparation des cassures pour des doses qui permettent une survie voisine de 100% aux bactéries irradiées (figure 5) (Lecointe et al., 2004).

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L’analyse globale de l’expression des gènes après irradiation ou dessication (analyse transcriptomique) s’est révélée très fructueuse pour identifier de nouveaux gènes impliqués dans la radiotolérance de la bactérie D. radiodurans (Tanaka et al., 2004). Elle a permis de mettre en évidence des gènes n’ayant pas d’équivalent dans les autres génomes séquencés (gènes orphelins) et qui sont fortement induits après exposition aux rayonnements ionisants ou dessication prolongée. Alors que 72 gènes sont induits par irradiation et 73 gènes par dessication / réhydratation, 33 sont communs aux deux réponses (Tanaka et al., 2004). On retrouve parmi ces 33 gènes, le gène recA, des gènes impliqués dans la réparation par excision de nucléotides, dans l’adaptation au stress oxydatif ou au choc thermique, dans la restoration du surenroulement de l’ADN mais la majorité des gènes induits sont orphelins. Les 5 gènes les plus induits sont communs aux deux réponses et codent des protéines de fonction inconnue. L’inactivation de ces gènes montre l’importance de certains dans la tolérance de D. radiodurans aux radiations. La purification des produits de deux de ces gènes, DdrA et PprA, et leur caractérisation biochimique a permis de montrer que (1) la protéine DdrA se fixe aux extrémités de l’ADN simple-brin et empêche la dégradation de celui-ci par des exonucléases (Harris et al., 2004) (2) la protéine PprA se fixe sur un ADN double brin qui porte des cassures simple ou double brin, protège les extrémités de la dégradation par des nucléases et facilite la ligation de fragments d’ADN en stimulant l’activité d’ADN-ligases (Narumi et al., 2004).

L’inactivation des gènes ddrA et pprA a permis de montrer que ces protéines jouent un rôle crucial dans la radiorésistance suggérant l’existence de mécanismes originaux de réparation des cassures de l’ADN chez cette bactérie.
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4- Structuration du génome de D. radiodurans
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Des analyses par microscopie électronique ont montré que le nucléoide de D. radiodurans est organisé sous forme d’un toroide fortement structuré, structure maintenue après exposition à de fortes doses d’irradiation. Cette structuration particulière du génome pourrait jouer un rôle clé dans la réparation, en évitant la dispersion des fragments dans la cellule, en maintenant la proximité des extrémités et la continuité linéaire du génome fragmenté. Cette structure pourrait favoriser un mécanisme de réparation de l’ADN par recollement des extrémités (Levin-Zaidman et al., 2003). Une étude plus large portant sur la comparaison de la structure du nucléoide de 7 espèces différentes de Deinococcacae, de la bactérie radiorésistante Rubrobacter radiotolerans et de la bactérie Thermus aquaticus phylogénétiquement proche des Deinococcacea mais radiosensible a permis de montrer que la structure torroidale du nucléoide de D. radiodurans n’était conservée que chez D. murrayi, D. proteolyticus, D. radiophilus, D. grandis (Zimmerman and Battista, 2005). L’ADN de R. radiotolerans se présente sous forme de plusieurs sphères fortement condensées dans la cellule alors que les génomes de D. radiopugnans et D. geothermalis ne présentent pas d’organisation particulière (Zimmerman and Battista, 2005). D. radiodurans contient 4 à 10 copies de son génome par cellule (Harsojo et al., 1981) ; il a été proposé que les différentes copies soient préalignées, favorisant la recherche d’homologie dans un mécanisme de réparation par recombinaison homologue et la fidélité de la réparation. Cependant l’existence d’un tel alignement n’a pas pu être démontrée.
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Conclusion
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La résistance exceptionnelle de D. radiodurans au rayonnement ionisant et à des cycles répétés de dessication-réhydratation semble être la conséquence de processus d’évolution qui augmentent l’efficacité des mécanismes connus de réparation de l’ADN. Chaque mécanisme contribue probablement de façon modeste mais, ensemble, ils sont capables de conférer à D. radiodurans cette exceptionnelle capacité à réparer les cassures de l’ADN.

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L’auteur, Suzanne Sommer, est professeur à l’Université Paris Sud. Elle dirige le Groupe Radiorésistance et mutagénèse chez les Deinococcaceae à l’Institut de Génétique et Microbiologie.

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Par Céline Brochier

I. Introduction

1/ Quelques aspects historiques
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Découverte

L’origine du terme « cellule » remonte au 17ième siècle. C’est le savant Robert Hooke qui fut à la fois physicien, chimiste, biologiste, astronome, inventeur, architecte, qui introduit le mot en biologie dans son ouvrage, les Micrographia (1667), qui décrit les observations qu’il a faites avec un microscope de sa fabrication. En particulier, en observant un morceau de liège, il remarqua des cavités délimitées par des parois de cellulose et de suber qu’il nomma « cellules ». Toutefois, ni Hooke, ni ses contemporains ne comprirent l’importance de cette notion et c’est seulement au XIXème siècle qu’elle s’imposa.

Théorie cellulaire

Le botaniste allemand Matthias Schleiden et son ami Theodor Schwann proposèrent, dans une note de 1839, l’hypothèse, preuves microscopiques à l’appui, que tous les êtres vivants, plantes, animaux, moisissures, sont constitués d’un ensemble d’unités de construction de même type, les cellules. La théorie cellulaire, devait donner naissance à une synthèse unificatrice qui constitue en biologie, au même titre que la théorie atomique en physico-chimie, une de ses plus solides fondations. La théorie cellulaire définit la cellule comme l’unité d’organisation structurale des systèmes vivants. Certains d’entre eux sont formés d’une unique cellule autonome (ce sont les organismes unicellulaires), tandis que d’autres sont formés de plusieurs cellules différenciées du point de vue de la forme et des fonctions (ce sont les organismes pluricellulaires). En 1855, à la suite des travaux de Robert Remak (1815-1865), Rudolf Virchow (1821-1902) formule le second axiome de la théorie cellulaire : toute cellule provient d’une autre cellule. On peut résumer la théorie cellulaire ainsi : tous les êtres vivants sont constitués d’unités microscopiques, les cellules et chaque cellule possède les propriétés caractéristiques du vivant.

2/ Chaque cellule possède les propriétés caractéristiques du vivant

Le problème de la définition de la cellule minimale est intimement lié à celle de la vie. Les recherches tournant autour de ce qui est vivant sont multiples : vie artificielle, vie-prébiotique, modèles cellulaires… Or paradoxalement, il n’existe pas de définition consensuelle de ce qui est vivant. Les définitions de ce qu’est la vie sont rares et ont souvent changé au cours du temps 1. Le problème majeur rencontré est que cette définition doit (1) être applicable largement (aux objets terrestres mais aussi à l’infinité des objets extra-terrestres), (2) être suffisamment précise pour permettre une distinction fine entre ce qui est vivant et ce qui ne l’est pas (des virus, une cellule morte, un cristal en croissance), et (3) ne pas être trop restrictive car elle doit inclure tout ce qui est vivant actuellement ainsi que les formes de vie hypothétiques antérieures. On pourra néanmoins retenir cette définition proposée par la NASA en 1997 est vivant « Un système qui est délimité sur le plan spatial par une membrane semi-perméable de sa propre fabrication, qui est capable de s’auto entretenir et de se reproduire en fabriquant ses constituants à partir d’énergie et/ou de matériaux bruts extérieurs. ». Toutes les cellules (considérées comme des systèmes vivants possèdent les trois caractéristiques du vivant : l’autoconservation (récupérer des éléments du milieu et les transformer en produits nécessaires à la survie), l’autorégulation (contrôler la fabrication de ces produits) et l’autoreproduction (produire un système ayant ces 3 caractéristiques).

3/ Caractéristiques des cellules actuelles

A) Stockage de l’information héréditaire sous forme d’ADN et sa transmission

Toutes les cellules vivantes sans aucune exception connue conservent leur information génétique sous forme d’une ou plusieurs molécules d’ADN (acide désoxyribonucléique) double brin (Figure 1). Chaque brin est un polymère non ramifié de désoxyribonucléotides, eux-mêmes constitués d’un sucre (déoxyribose), relié à un groupement phosphate et à une base azotée (Figure 1). Il existe quatre types de bases donnant leur spécificité aux nucléotides : Adénine (A), Cytosine (C), Guanine (G) et Thymine (T). Les deux brins constituant la molécule d’ADN sont appariés par complémentarité des bases (Adénine/Thymine, Cytosine/Guanine).

Figure1 : Structure de l’ADN

Lors de la reproduction cellulaire, processus par lequel une cellule mère va se diviser, l’intégralité de son information génétique est transmisse aux cellules filles qui portent donc la même information génétique que la cellule qui leur a donné naissance. Cela signifie que l’information génétique portée par la cellule mère doit être préalablement dupliquée. Ce processus duplication de l’ADN s’appelle la réplication. Chez toutes les cellules actuelles cette réplication se fait grâce à une matrice et à l’intervention de nombreuses protéines. Lors de la réplication les deux brins constituant la molécule d’ADN se séparent et chaque brin va servir de matrice aux nouveaux brins qui vont être synthétisés (Figure 2). L’ajout de nucléotides va se faire en suivant les règles d’appariement des bases (A avec T et C avec G). A la fin de la réplication, on obtient deux molécules d’ADN identiques et identiques à la molécule d’ADN initiale. On appelle ce mode de réplication de l’ADN semi-conservatif car chaque nouvelle molécule d’ADN est constituée d’un brin de la molécule d’ADN initial et d’un brin complémentaire néosynthétisé.

Figure 2 : Réplication de l’ADN

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B) Transcription de l’information héréditaire sous la forme d’un intermédiaire l’ARN

L’ADN sert de support à l’information génétique (les gènes). Les gènes sont des segments d’ADN contenant les instructions nécessaires à la fabrication de deux types de molécules clés indispensables à toutes les cellules : l’ARN et les protéines. Cependant l’information contenue dans les gènes n’est pas utilisée directement par les cellules. Toutes les cellules actuelles recopient les parties de l’information génétique qu’elles souhaitent utiliser sous la même forme intermédiaire : l’ARN (acide ribonucléique). L’ARN est un polymère simple brin non ramifié de ribonucléotides, formés d’un sucre (le ribose), lié à un groupement phosphate et à une base azotée. La principale différence entre l’ADN et l’ARN (outre la nature du sucre qui est légèrement différente) tient à la nature des bases utilisées. Pour fabriquer de l’ARN les cellules utilisent quatre types de bases azotées : l’adénine (A), la cytosine (C), la guanine (G) et l’uracile (U). Contrairement à l’ADN on ne rencontre pas de thymine dans l’ARN mais de l’uracile. La fabrication des ARN se fait au cours de la transcription. La première étape est la séparation des brins d’ADN où est localisée l’information génétique à transcrire (Figure 3). Lors de la seconde étape le brin d’ARN est synthétisé à partir de la séquence d’ADN complémentaire contenant l’information à transcrire. Cette transcription fait appel à de nombreux acteurs protéiques.

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Figure 3 : Transcription de l’ADN

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C) Traduction de l’ARN intermédiaire en protéines

Seuls un petit nombre des ARN intermédiaires fabriqués à partir de l’ADN sont conservés sous forme d’ARN. La majorité d’entre eux sont traduits en protéines. Les protéines sont des polymères non ramifiés d’acides aminés remplissant des fonctions fondamentales dans la cellule (catalyseur de réactions chimiques, maintient des structures, génération et détection de mouvements, processus informationnels : réplication, transcription, traduction, régulation de l’expression des gènes…). Il existe 20 types d’acides aminés. Chaque acide aminé est construit sur le même schéma : un atome de carbone central sur lequel se greffent un groupement acide (COOH), un groupement amine (NH2), un radical et un atome d’hydrogène. C’est la nature du radical qui spécifie le type d’acide aminé. Chaque protéine possède une séquence linéaire (séquence primaire) d’acides aminés propre qui va dépendre de la séquence de l’ARN à partir de laquelle elle a été fabriquée. Cette chaîne linéaire va se replier adoptant une structure 3D qui donne à la protéine ses propriétés (Figure 4). Lors de la traduction, les nucléotides portés par l’ARN intermédiaire vont être « lus » par un complexe macromoléculaire : le ribosome. Ce système est composé d’ARN et de nombreuses protéines. Le ribosome lit les nucléotides 3 par 3 (on parle de triplet de nucléotides ou de codon) de manière non chevauchante. Les ARNt, petites molécules d’ARN, sont liés à un acide aminé spécifique à une extrémité, et possèdent à l’autre extrémité une séquence particulière de 3 nucléotides appelée anticodon. Cet anticodon va essayer de se lier au codon examiné par le ribosome. Si l’anticodon de l’ARNt est complémentaire du codon considéré, alors l’acide aminé qu’il porte va être incorporé dans la chaîne en cours de synthèse (Figure 5).

D) Régulation de l’expression de l’information génétique

Les molécules d’ADN sont de grande taille et contiennent des milliers de gènes (chacun spécifiant une protéine ou un ARN). Cependant, la cellule n’exprime pas constamment l’ensemble de ses gènes. Elle ajuste le taux de transcription et de traduction des différents gènes en fonction de ses besoins et des conditions du milieu grâce à un système de régulation très perfectionné. Ce système de régulation consiste en une grande diversité de protéines régulatrices capables de se lier à des régions non codantes qui parsèment l’ADN du génome. La liaison protéine régulatrice – séquence régulatrice va permettre l’expression du ou des gènes associés ou contraire l’inhiber. La quantité et l’organisation des séquences régulatrices varie d’un organisme à l’autre mais la stratégie de base et la même. Le génome cellulaire ne dicte pas seulement la nature des protéines que la cellule est capable de fabriquer mais aussi le moment et l’endroit où elles doivent être fabriquées.

E) Besoin d’énergie libre + matériaux bruts

Une cellule est un système éloigné de l’équilibre chimique : elle possède une grande quantité énergie interne. Cela signifie que si on la laisse mourir et se dégrader jusqu’à atteindre l’équilibre une grande quantité d’énergie sera libérée. L’approvisionnement en énergie est donc indispensable pour que la cellule puisse se maintenir (synthèse d’ADN, ARN de protéines, de lipides, division cellulaire, mouvement…). En plus d’une source d’énergie, elle a besoin de matériaux bruts à partir desquels elle fabriquera ses propres constituants. Même si toutes les cellules utilisent les mêmes constituants cellulaires de base (sucres, lipides, ADN, protéines, nucléotides, acides aminés…) et le même transporteur d’énergie (la molécule d’ATP), les sources d’énergie ainsi que les matériaux bruts importés diffèrent selon les cellules. Par exemple, certaines cellules comme les cellules végétales utilisent l’énergie solaire et quelques nutriments très simples pour fabriquer l’ensemble de leurs constituants alors que d’autres comme les animaux, qui se nourrissent d’autres êtres vivants, dont ils tirent l’énergie et une grande partie des molécules organiques qu’ils sont incapables de fabriquer (on parle d’auxotrophie). D’autres cas plus extrêmes concernent certains pathogènes qui ont perdus la capacité de fabriquer un grand nombre (voir la quasi totalité) des molécules de base de leurs constituants. Ils prélèvent les molécules dont ils ont besoins auprès de leur hôte (voir le cas des mycoplasmes ci-dessous).

F) Délimitation spatiale par une membrane plasmique

Toutes les cellules sont entourées d’une membrane plasmique semi-perméable qui maintient son intégrité et qui agit comme une barrière sélective qui permet à la cellule d’importer des matériaux bruts, de concentrer ses produits de fabrication et d’exporter ses déchets. Elle est constituée de principalement de lipides et de protéines spécialisées qui permettent le transport spécifique de molécules au travers de la membrane. Le type des protéines membranaires va déterminer quel type de molécules la cellule est capable d’importer.

II. La cellule minimale

1/ Définition du problème

La question de la définition d’une cellule minimale peut se résumer ainsi : « Quel est le plus petit set de gènes nécessaires et suffisants pour maintenir une forme de vie cellulaire moderne, c’est-à-dire capables d’assurer toutes les fonctions cellulaires décrites ci-dessus et possédant les 3 caractéristiques du vivant ». Les tentatives de réponses se sont limitées à la définition du protéome minimal (c’est à dire à l’ensemble des protéines nécessaires à la cellule minimale) en ne tenant pas compte des systèmes de régulations et des régions non codantes existant dans les chromosomes dont toute la complexité n’est pas encore comprise. Implicitement on suppose que cette cellule minimum est placée dans les conditions les plus favorables (1) en présence de tous les nutriments essentiels dont elle pourrait avoir besoin (i.e. cette cellule n’a donc pas besoin de les fabriquer) et (2) en absence de tout stress environnemental. Ceci implique qu’elle n’est pas censée survivre à tous les changements de l’environnement auxquels serait confrontée une cellule réelle. Intuitivement on s’attend à ce que ce set gènes recouvre l’ensemble des grandes fonctions communes à toutes les cellules sans pour autant savoir combien de gènes sont nécessaires au maintien de chaque fonction. La recherche de la cellule minimum a commencé à la fin des années 60. Depuis deux grands axes de recherche ont été développés pour appréhender cette question : (1) les méthodes expérimentales (in vivo) et (2) les méthodes de bioinformatique de comparaison du contenu en gènes des génomes cellulaires (in silico).

A) Méthodes expérimentales

a. Principe :

Identifier les gènes indispensables dans des conditions de croissance particulières chez des organismes modèles en générant des mutations classées en fonction de leur létalité : Un gène qui lorsqu’il est muté donne un phénotype létal sera qualifié d’indispensable et de non-indispensable sinon.

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* Stratégies de mutagenèse massives par des transposons : L’objectif est de saturer le génome des cellules par l’insertion de transposons (séquences d’ADN) qui vont inactiver les gènes lorsqu’elles s’insèrent à l’intérieur de ces derniers. Si des cellules sont capables de croître malgré tout, cela signifie qu’aucun transposon n’a atteint de gènes indispensables. Les gènes pour lesquels aucune insertion n’est observable sont identifiés comme indispensables. Ce type d’étude a été réalisé chez Mycoplasma genitalium, une bactérie pathogène à faible taux de G+C qui possède l’un des plus petits génomes cellulaires connus (480 gènes pour une taille de 540kb). A cause de son très petit génome il était supposé que le génome de M. genitalium est composé principalement de gènes indispensables (par exemple 1/3 de ses gènes interviennent dans la fabrication des protéines, Figure 5). De manière surprenante, cette étude montre que 180-215 gènes présents chez M. genitalium seraient non-indispensables ce qui représente 1/3 à 1/2 de ses gènes. Cependant comme attendu, les catégories fonctionnelles contenant la plus forte proportion de gènes indispensables sont celles liées aux processus cellulaires fondamentaux (fabrication des protéines, métabolisme des lipides, production d’énergie, reproduction, transport…). Il est intéressant de noter que 67 gènes indispensables ont des fonctions inconnues, impliquant que (1) tous les processus cellulaires fondamentaux n’ont pas encore été identifiés et/ou (2) que ces gènes correspondent à des fonctions connues mais n’y ont pas été reliés. Une interprétation plus fine ces résultats nécessiterait un travail expérimental poussé, mais on peut déjà voir émerger l’idée que le set de gènes indispensables est dépendant de l’environnement dans lequel on le définit. Par exemple le fait que 60 % des gènes impliqués dans l’enveloppe cellulaire soient non-indispensables peut signifier qu’ils peuvent être importants pour la cellule dans son environnement naturel (lors de l’infection de son hôte) mais inutiles dans les conditions de culture en laboratoire.

Figure 5 : Répartition des gènes de M. genitalium dans les grandes catégories fonctionnelles

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Figure 6 : Proportion des gènes indispensables/non-indispensables dans chaque catégorie fonctionnelle

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* L’inhibition de l’expression des gènes par l’utilisation d’ARN anti-sens : Principe : Stratégie consistant à bloquer la traduction des ARN intermédiaires sans que la séquence du gène correspondant ne soit altérée. Elle est basée sur la fabrication d’ARN dits « anti-sens » complémentaires de la séquence d’un ARN produit par le gène étudié. Lorsque de dernier est transcrit, l’ARN produit va s’associer avec l’ARN ani-sens provoquant un blocage de la traduction.

Une étude a été menée chez Staphylococcus aureus (une bactérie pathogène gram positive à bas taux de G+C comptant 2595 gènes) 7. Parmi les milliers d’ARN anti-sens produits, ceux correspondants à 658 gènes induisent un phénotype l’étal. La comparaison de ces 658 gènes potentiellement indispensables avec les gènes présents chez M. genitalium montre que 168 ont été identifiés comme indispensables chez ce dernier (cf. mutagenèse par transposons) et se répartissent dans un petit nombre de catégories fonctionnelles (Tableau 2, Figure 7 et 8). Il peut paraître surprenant que la majorité des gènes indispensables chez S. aureus (658-168=490) soit absents chez M. genitalium. Cela montre qu’il existe des différences majeures entre les organismes : des gènes indispensables chez l’un ne le seront peut-être pas chez l’autre. Par exemple M. genitalium ne possède pas paroi contrairement à S. aureus. Il apparaît donc normal que des gènes indispensables au maintient de la paroi chez S. aureus soient absent chez M. genitalium.

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Figures 7 et 8 : Répartition des 168 gènes indispensables chez S. aureus et présents chez M. genitalium en fonction de leur catégorie fonctionnelle

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* L’inactivation systématique des gènes présents dans un génome : Cette méthode consiste à remplacer la séquence d’un gène dans un génome par une séquence inactive de ce même gène. Elle a été appliquée chez Bacillus subtilis (organisme modèle bactérien appartenant au groupe des bactéries gram positives à bas taux de G+C, 15). Le génome de cette bactérie contient 4100 gènes parmi lesquels 271 seraient indispensables pour la croissance de B. subtilis lorsqu’ils sont inactivés un par un. 80% de ces gènes essentiels appartiennent à quelques grandes catégories fonctionnelles clés (Tableau 3, Figures 9 et 10).

Figures 9 et 10 : Répartition des gènes indispensables chez B. subtilis selon leur catégorie fonctionnelle

b. Limites de ces approches :

Même si ces méthodes expérimentales donnent des résultats intéressants, elles possèdent un certain nombre de limites. Par exemple, l’insertion des transposons sous-estime très probablement la quantité de gènes réellement essentiels car certains d’entre eux peuvent être résistants à l’insertion de transposons et être classés à tort dans la catégorie des gènes non-essentiels. L’utilisation de d’ARN anti-sens peut conduire à une surestimation du nombre de gènes indispensables dans le cas d’ARN polycistroniques (ARN intermédiaire unique permettant la traduction simultanée de plusieurs protéines). L’ARN anti-sens d’un gène non essentiel situé dans un ARN polycistronique peut conduire à la non-traduction de l’ensemble des protéines (dont certaines peuvent être essentielles). De plus un ARN anti-sens complémentaire d’un motif partagé par un ensemble de gènes peut inhiber la totalité des gènes partageant ce motif. L’inactivation de gènes chez B. subtilis qui possède un gros génome peut biaiser l’estimation du nombre de gènes indispensables, car il a été montré que une fonction essentielle peut parfois être assurée par plusieurs gènes présents dans le génome (c’est ce qu’on appelle la redondance génomique). Ce phénomène est très fréquent dans le cas de gènes paralogues (gènes issus d’un événement de duplication et pouvant avoir conservé des fonctions proches), or 50% du génome de B. subtilis est composé de gènes paralogues. Enfin il ne faut pas oublier qu’elles permettent de définir le set de gènes essentiels à un organisme bactérien précis dans des conditions environnementales fixées. D’un environnement à l’autre et d’un organisme à l’autre, la composition de ce set minimum de gènes peut varier. De même, le fait qu’un gène soit indispensable ou non dépend du contexte génomique dans lequel il se trouve. Il existe des inactivations mutuellement exclusives. Par exemple la délétion du gène X ou du gène Y peut être tolérée individuellement suggérant que ni X ni Y n’est indispensable mais pas la délétion simultanée de X et Y qui induit un phénotype létal. Par exemple la délétion des deux gènes nrdA et nrdD chez E. coli inhibe sa croissance en aérobie et en anaérobie conduisant à un phénotype létal. Ceci illustre que le set minimal de gènes indispensables n’est pas équivalent au génome minimum car des gènes non essentiels individuellement ne le sont pas collectivement. Inversement il peut exister des délétions inclusives, l’inactivation du gène X ou du gène Y conduit à un phénotype létal suggérant que ces gènes sont indispensables alors que leur délétion simultanée peut conduire à un phénotype viable. Par exemple il a été mis en évidence chez E. coli un système toxine / antitoxine. La délétion du gène codant pour l’anti-toxine conduit à la mort des cellules, alors que la délétion combinée du gène codant pour la toxine et l’anti-toxine restore la viabilité. Pour réaliser des études vraiment fines il faudrait étudier l’inactivation de combinaisons de gènes et non de gènes individuels ce qui est impossible actuellement.

c. Discussion :

Les approches expérimentales ont été réalisées principalement sur des cellules bactériennes car elles possèdent déjà des petits génomes. En dépit de leurs limitations, une cellule minimale semble en émerger : c’est une cellule bactérienne simple consistant en un compartiment délimité par une membrane et réalisant les fonctions caractéristiques des cellules : (1) la réplication, (2) la division du compartiment, (3) la fabrication de protéines, et (4) un métabolisme sommaire pour la production d’énergie (la glycolyse). Il est important de noter la totale absence de facteurs de régulation de l’expression des gènes. Le nombre de gènes estimés varie de 168 à 500. 80% des gènes essentiels chez B. subtilis sont présents chez toutes les bactéries ayant des génomes d’une taille supérieure à 3 Mb alors que seuls 57 % sont trouvés chez toutes les bactéries. Les gènes qui sont absents des génomes bactériens de petite taille sont ceux impliqués dans la synthèse de la paroi cellulaire, la forme et la division cellulaire, le métabolisme et la fabrication de nombreux composants. Ceci n’est pas surprenant car les plus petits génomes bactériens correspondent à des pathogènes au mode de vie ultra-spécialisé, qui ont perdu un grand nombre de gènes et se retrouvent avec de nombreuses auxotrophies. Il résulte également de ces études que les gènes indispensables sont très souvent présents en un seul exemplaire dans les génomes alors que ceux qui présentent le plus fort taux de redondance sont souvent non indispensables. Ceci peut paraître paradoxal car on pourrait s’attendre à ce que les gènes impliqués dans des fonctions cellulaires indispensables soient fortement redondants (cela permet de limiter les dégâts en cas de perte de l’un d’entre eux). Ceci suggère que la stratégie adoptée par ces organismes concernant la redondance des gènes qui est plus axées sur l’adaptation à des changements de conditions environnementales que sur la « sauvegarde » des gènes assurant des fonctions cellulaires indispensables.

B) Comparaison du contenu en gènes des génomes

a. Principe : Cette approche repose sur l’idée simple et astucieuse que toutes les cellules actuelles possèdent une caractéristique commune : ce sont des cellules. Cette caractéristique a été héritée d’un même ancêtre commun, le dernier ancêtre commun à toutes les cellules actuelles qu’on appelle LUCA. Il semble donc logique de supposer que toutes les cellules ont également héritées de LUCA de l’ensemble des gènes nécessaires à la fabrication et au fonctionnement d’une cellule (ces derniers ainsi que de nombreux gènes accessoires variables d’une cellule à l’autre constituent les génomes modernes). Donc en comparant le contenu en gènes des génomes modernes, il est théoriquement possible d’identifier tous les gènes hérités de ce dernier ancêtre commun et qui ont été retenus par toutes les cellules au cours de l’évolution. Compte tenu de la grande capacité des procaryotes à perdre des gènes au cours de l’évolution, il est très probable que ces gènes conservés chez tous les êtres vivants sont majoritairement ceux qui définissent l’essence de la cellule. Cependant les choses ne sont pas aussi simples car au cours de l’évolution peuvent se produire ce qu’on appelle des remplacements non-orthologues de gènes. Ceci a pour conséquence que des gènes non-orthologues peuvent assurer des fonctions similaires au sein des cellules 17, compliquant l’identification de ce qui est conservé entre les génomes.

La première mise en œuvre date de 1996 et recherchait les orthologues conservés chez deux bactéries pathogènes M. genitalium et d’Haemophilus influenzae (468 gènes pour 0.58 Mb et 1700 gènes pour 1.83 Mb, respectivement) qui ont divergé à partir d’un ancêtre commun il y a plus de 1.5 milliard d’années 16. Le protocole suivit est le suivant : (1) identifier tous les orthologues communs aux deux génomes (233 gènes), (2) étudier les « trous » dans les fonctions cellulaires clés afin d’identifier les remplacements non orthologues potentiels et compléter la liste des gènes (23 gènes) et (3) éliminer les gènes apparemment redondants et/ou spécifiques du mode de vie parasite (6 gènes).

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Les % entre parenthèse représente la fraction des gènes chez M. genitalium en fonction des catégories fonctionnelles. Ex. 95/98 (97%) des gènes impliqués dans la traduction chez M. genitalium sont conservés chez H. influenzae ; 3/98 ne sont pas conservés chez H. influenzae.

b. Discussion :

Cette approche a permis d’identifier dans ces deux bactéries 256 gènes conservés supposés être nécessaires et suffisants pour permettre une vie cellulaire moderne et être proche du set minimum de gènes. Il est important de noter que ce chiffre est assez compatible avec ceux obtenus par les méthodes expérimentales. En particulier la cellule théorique contient (1) un système presque complet de traduction ; (2) une machinerie de réplication de l’ADN ; (3) un système rudimentaire de réparation et de recombinaison de l’ADN ; (4) un système de transcription presque complet mais sans de facteur de régulation ; (5) des chaperonnes ; (6) un métabolisme intermédiaire anaérobie virtuellement restreint à la glycolyse ; (7) pas de système de synthèse des acides aminés ; (8) pas de système de synthèse de novo des nucléotides ; (9) une voie de biosynthèse des lipides limitée (absence de synthèse des acides gras) ; (10) un système d’exportation des protéines et (11) un répertoire limité de protéine de transport de métabolites (Tableau 4 et Figures 11 et 12). Les besoins nutritifs d’une telle cellule sont assez considérables si on considère qu’elle aurait besoin d’importer tous ses acides aminés, tous ses nucléotides, tous ses acides gras et ses coenzymes complexes.

Figures 10 et 11 : Nombre / Fraction des gènes conservés chez M. genitalium et conservés ou absents chez H. influenzae dans les différentes catégories fonctionnelles

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c. Limites de cette approche :

Ce qui a été reconstruit par cette approche est probablement plus un génome bactérien minimum (puisquecetteanalysecomparedeux génomes bactériens) qu’un génome minimal cellulaire en général car il est très probable quece génome minimal comporte des solutionsbactériennespour certaines fonctions. De plus certains de ces gènes prédits comme indispensables ont pu être inactivésexpérimentalement par l’insertionde transposons suggérantquecertains de ces gènes ne sont pas aussi indispensables que ce qui avait été prédit. De plus, selon les organismes comparés le set de gènes orthologues peut varier de manière considérable. En particulier, l’inclusion d’un plus grand nombre de génomes très divergents dans ce style d’analyse diminue très fortement la taille du set de gènes conservés entre les génomes. Par exemple, la même étude appliqué aux sets de protéines codées par 21 génomes microbiens et archébactériens, aboutit à une liste de 52 gènes (Tableau 5). Cette liste de protéines comprend principalement des protéines impliquées dans la formation du ribosome et la biosynthèse des protéines, mais n’est pas suffisante pour construire une cellule cohérente ni même un ribosome fonctionnel. En effet, un biais important a été introduit dans cette étude : l’inclusion de plusieurs parasites obligatoires, qui ont une biochimie extrêmement simplifiée. Cependant si une tolérance de une à deux absences est incluse, on peut ajouter 11 gènes et du coup des fonctions cellulaires préalablement absentes, comme la glycolyse ou un métabolisme des nucléotides, commencent à apparaître.

Finalement, se pose également le problème de la trop grande divergence entre les orthologues très éloignés (au-delà de toute reconnaissance) ainsi que du remplacement non homologue de gènes (ce phénomène qui touche potentiellement toutes les classes d’enzymes et tous les processus biologiques pourrait atteindre 5% des gènes présents dans le génome minimal). C’est pourquoi une approche légèrement différente mais surtout moins restrictive a été proposée : la recherche de fonctions universelles conservées qui ne se focalise plus sur la recherche d’orthologues conservés entre les génomes mais sur l’identification de groupes d’orthologues (COG) impliqués dans des fonctions semblables. Cette approche a été permis par le développement d’une base de données de clusters d’orthologues associés à des annotations fonctionnelles 19. En examinant ces clusters on peut remarquer que 327 paires clusters « universels » ont des annotations fonctionnelles similaires. Par exemple les clusters de gènes orthologues COG0406 et COG0696 contiennent des phosphoglyceromutases et illustrent le cas probable d’un remplacement non-orthologue (alternatives évolutives pour la réalisation de la même fonction). Parallèlement à l’utilisation des COGs, ce sont les groupes d’organismes (et non plus organismes individuels) qui sont considérés ce qui limite considérablement l’impact des multiples auxotrophies des organismes parasites. La cellule inférée par la recherche de fonctions universelles conservées possèderait quelques 320 gènes et pourrait synthétiser de novo ses acides aminés, ses nucléotides, des carbohydrates complexes et quelques coenzymes et ne dépendre plus que d’un petit nombre de précurseurs prélevés dans l’environnement.

Les grandes catégories fonctionnelles absentes du génome minimal ne sont pas de peu d’importance. Par exemple, plusieurs protéines impliquées dans la réplication de l’ADN ne sont pas orthologues entre les bactéries d’une part et les eucaryotes/archébactéries d’autre part. Les explication proposées sont que (1) l’ADN et les protéines qui lui sont associées sont apparus indépendamment dans la lignée bactérienne et dans la lignée archées + eucaryotes, (2) que le dernier ancêtre commun possédait un génome à ADN avec un système de réplication très rudimentaire (on trouve quelques protéines clairement homologues entre les trois domaines), mais que dans ce cas là, la réplication a évolué dans différentes directions après la divergence archées + eucaryotes et bactéries par recrutement indépendant de protéines ou (3) que des remplacements non orthologues à partir d’un ancêtre commun à ADN se sont produits 20. De même peu d’enzymes de réparation de l’ADN sont orthologues entre les trois domaines et peu d’enzymes impliquées dans la biosynthèse des lipides sont orthologues entre eucaryotes/bactéries et archées (ce qui est en accord avec l’observation de différences entre les lipides composants la membrane de ces organismes). Quels que soient les mécanismes impliqués et la lignée dans laquelle le remplacement non orthologue a eu lieu, le génome d’une cellule minimale doit remplir l’ensemble des fonctions caractéristiques de la cellule et doit donc être complété par des gènes pouvant les assurer. L’inclusion des solutions eucaryotes, bactériennes ou archébactériennes pour certaines fonctions conduira à des alternatives pour la construction du génome minimum.

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III. Peut-on définir le génome minimum ?

Les différentes approches développées pour définir une cellule minimale sont relativement congruentes du point de vue du contenu moyen en gènes (Tableau 6). Un consensus autour de 250-300 gènes semble raisonnable.

Il est intéressant de noter que plusieurs fois au cours de l’évolution, des phénomènes de réduction génomique se sont produits indépendamment aboutissant à des génomes très réduits et différents selon les lignées considérées. La perte de gènes peut être vue d’un point de vue évolutif comme l’engagement dans des voies à sens unique : la perte d’un ou de plusieurs gènes peut entraîner des changements irréversibles que même l’acquisition de nouveaux gènes ne saurait compenser. Par exemple les mycoplasmes ont perdu de nombreux gènes impliqués dans la régulation de la transcription. Ceci a peut-être été rendu possible par un déplacement de la régulation de l’expression des gènes au niveau de la traduction. De même la perte d’un très grand nombre de transporteurs chez M. genitalium a peut-être accru la pression de sélection pour la conservation des transporteurs ayant une large spécificité de substrat.. De même, la perte de gènes peut limiter le nombre et le type de pertes qui seront tolérées dans le futur, c’est pourquoi la définition d’un génome minimum à partir de l’expérimentation sur matériel vivant va donc aboutir à des résultats différents selon les organismes considérés, car selon les lignées, ce n’est pas le même répertoire de gènes qui est présent. De même, la relation étroite entre environnement et génome va influer sur la réponse en définissant ce qui est indispensable et ce qui ne l’est pas, relativement à un environnement : selon l’environnement différentes solutions au problème du génome minimum pourront être proposées.

Malgré une réduction génomique parfois très importante, les plus petits génomes actuels comme ceux des mycoplasmes restent beaucoup plus grands que les génomes minimaux prédits par des méthodes bioinformatiques (même si on retire les 10% de gènes spécifiques liés à leur mode de vie parasitaire). La différence qu’il reste entre ces génomes réduit et les génomes minimaux inférés reflète probablement la différence qu’il existe entre les génomes résultants de l’interaction de gènes pendant des millions d’années d’évolution et ayant subit une histoire évolutive et un génome qui serait fabriqué de novo par un ingénieur en rassemblant artificiellement des choses qui ont été inventées indépendamment dans différentes lignées évolutives (mélange de solutions eucaryotes, bactériennes et archébactériennes) pouvant même jusqu’à inventer de nouvelles solutions de toutes pièces pour contourner un problème donné.

Quoiqu’il en soit, il ressort des nombreuses études réalisées, qu’il est très probable qu’en pratique nous ne pourrons jamais proposer une réponse unique au problème de la cellule minimum car c’est en réalité une construction purement théorique, une abstraction. Ce n’est pas quelque chose qui a été expérimenté par la nature car elle requiert un environnement idéal libre de toute pression de sélection et pourvoyant à tous ses besoins. En pratique il existe un grand nombre de solutions possibles au problème de la cellule minimum qui dépendent du type de cellulaire considéré : on peut définir un génome minimum pour chaque type de métabolisme : quel est le génome minimal pour une cellule phototrophe capable de croître uniquement en présence de CO2, de lumière et sels inorganiques, quel est le génome minimum pour une cellule hétérotrophe simple (capable de croître uniquement en présence d’un milieu de base contenant une seule source de carbone organique comme le glucose et des sels inorganiques, quel est le génome minimal d’une cellule hétérotrophe plus complexe nécessitant des milieux de culture plus riches (parfois même incomplètement caractérisés, comme du sérum), quel est le génome minimum d’un parasite cellulaire obligatoire ?…

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L’auteur, Céline Brochier, est maître de conférences à l’université de Provence Aix-Marseille 1, en biologie. Elle est spéacialiste de la phylogénie des êtres vivants.

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Par Jean Cadet, Thierry Douki et Jean-Luc Ravanat